許多化合物可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生基因突變、較大范圍染色體損傷、重組和染色體數(shù)目異常等不同形式的DNA損傷，從而造成機體潛在的遺傳危害。致癌實驗可檢出機體DNA損傷及其損傷的形式并甄別這些化合物的致癌性，在實驗中呈陽性的化合物為潛在人類致癌劑和(或)致突變劑。致癌實驗可分為活體內(nèi)致癌實驗(整體動物實驗)與試管內(nèi)致癌實驗。比較于活體內(nèi)致癌實驗．試管內(nèi)致癌實驗具有簡單易行、快速靈敏的優(yōu)點。試管內(nèi)致癌實驗是采用組織細胞培養(yǎng)法來觀察致癌劑的致癌作用。實驗中真核細胞更能直接地檢出致癌劑對人類或其他高等生物的遺傳危害；根據(jù)致癌劑類別選擇合適的細胞，觀察細胞DNA損傷的形式及程度來判定致癌劑的致癌特性。
一、原理
DNA分子量很高且具有嚴密的超螺旋結(jié)構(gòu)。因此，在理想條件下，正常細胞DNA在電泳之后仍應(yīng)保持在原來位置。而DNA受損后，DNA片斷從嚴密的超螺旋結(jié)構(gòu)中釋放出來；由于這些DNA斷鏈分子量較小且堿變性為單鏈，所以在電泳電場中就可以離開核DNA在凝膠分子篩中向陽極移動，形成慧星狀圖像，故稱彗星試驗。DNA受損傷愈嚴重，產(chǎn)生的斷鏈和變性片斷就愈多，斷鏈也愈?。辉谙嗤娪緱l件下遷移的DNA量就愈多，遷移的距離就愈長。因此，通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可定量測定DNA損傷程度，確定致癌劑與DNA損傷效應(yīng)之間的關(guān)系。
二、材料與方法
(一)實驗材料
1．待檢人抗凝外周血。
2．磷酸鹽緩沖液PBS。
3．0．4mmol／LTris—HCl(pH7．5)。
4．0．5％正常熔點瓊脂糖(NMA)。
5．0．5％低熔點瓊脂糖(LMA)。
6．細胞裂解液 含2．5mol／L NaCl、100mmol／L Na2 EDTA、10mmol／L Tris—Hcl(pHl0)、1％肌氨酸鈉，用前加lO％二甲基亞砜。
7．電泳緩沖液1 mmol／L Na2EDTA、300mmol／L NaOH。
8．30 μg／ml溴化乙啶(EB)。
9．淋巴細胞分離液比重I．077~1．080g／ml。
(二)實驗方法
1．人外周血淋巴細胞分離從健康人靜脈采抗凝血0．5~lml，沿離心管管壁滴加在等體積淋巴細胞分離液液面上，3500 r／min離心2min，吸取中間層淋巴細胞于10ml離心管中，加磷酸鹽緩沖液(PBS)至5ml，1500r／min離心8min，如此重復(fù)洗滌細胞兩次，再將細胞懸于PBS，置4℃待用。
2．紫外線照射或化學(xué)處理取新鮮分離的淋巴細胞或其他細胞懸液，用PBS調(diào)整細胞濃度為1×105個細胞／ml，用待測化學(xué)物37℃處理2～4h或于冰水浴中經(jīng)紫外線照射，隨后將細胞保存在4℃或冰水浴中。
3．三層凝膠法制板將i00pI NMA 40℃預(yù)熱后滴在載玻片上，迅速蓋上干凈的蓋玻片，4℃凝固。將10p1含有1000個受檢人血淋巴細胞的PBS和75μl LMA 37℃預(yù)熱并混合，滴到*層瓊脂糖上，4℃凝固。滴加75μl 37℃預(yù)熱的LMA于第二層瓊脂糖上，蓋上蓋玻片4℃凝固。
4．細胞裂解將凝膠水平浸入新配制的預(yù)冷的4℃細胞裂解液，破壞細胞膜、核膜和其他生物膜。
5．DNA堿解旋將凝膠取出，用吸水紙吸干裂解液，并置于水平電泳槽的陽，電泳槽中盛有新配制的堿性電泳緩沖液，放置40min，使DNA在堿性條件下解螺旋。
6．單細胞電泳在電壓25V、電流300mA下，電泳40min。
7．中和與染色 電泳后將載玻片凝膠平放在小瓷盤內(nèi)，緩緩沿壁加入Tris—HCl(DH7．5)緩沖液，將凝膠淹沒15 min，再將Tris—HCl緩沖液吸去，用濾紙將盤內(nèi)液體吸干，再緩緩加入無水乙醇將凝膠浸埋lh。之后，吸去乙醇，晾干或室溫下過夜。每塊凝膠加50μl EB水溶液，再蓋上蓋玻片染色20min。
三、結(jié)果觀察
染色后的樣本應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下觀察電泳圖像，每個樣本隨機選擇25個細胞，盡快用目鏡測微尺測定核DNA直徑和DNA遷移的長度。有條件者可借助圖像分析儀進行分析。
