PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 鴨沙門氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Salmonella anatum | 貨號 | YSP97151 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強(qiáng)度信號,這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 細(xì)胞周期素F(CCNF)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 多主葡萄殼菌 1g 胞苷脫氨酶(CDA)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 莖點霉屬 10g 羧酸酯酶1(CES1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 大隱球酵母 50g 軟骨凝集蛋白(CHODL)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥97% (GC) 淡紫擬青霉 1g 糖合酶1(CHSY1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥99% 頂孢頭孢霉 10MG 網(wǎng)格蛋白交互子1(CLINT1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 葡萄座腔菌 100g 皮質(zhì)醇穩(wěn)定蛋白(CORT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 鑲邊鏈霉菌 25g 羧肽酶M(CPM)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 砂單胞菌 25g 復(fù)合素1(CPLX1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 蘇云金芽孢桿菌 5g 肉毒堿酰轉(zhuǎn)移酶(CRAT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 鴨疫里氏桿菌 100g 肉毒堿-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CORT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 枯草芽孢桿菌 25g 肘臀蛋白(CUBN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥97% 產(chǎn)氨短桿菌 100mg Cullin 1蛋白(CUL1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 1g 降鈣素受體(CTR)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 華特拉根瘤菌 5g 鈣聯(lián)接蛋白(CLGN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 75% 芽胞桿菌 5g 鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 94% 蠟樣芽孢桿菌 100mg 嵌合蛋白2(CHN2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 94% 馬泰勒蟲(青海剛察株) 500mg Cylindromatosis蛋白(CYLD)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 96% 枯草芽孢桿菌 1g 鴨沙門氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒內(nèi)吞作用輔助蛋白EPN1抗體LIF peptide 白血病抑制因子抗原1 Kit 內(nèi)吞作用輔助蛋白EPN2抗體LIFR/CD118 peptide 白血病抑制因子受體抗原100 ul 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白ERGI3抗體Lingo-1 Nogo受體作用蛋白抗原1 Kit 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化物蛋白Ero1-Lα抗體LIS1(Lissencephaly-1 proin) 無腦回的致病基因LIS1抗原1 Kit 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp19抗體LFABP/FABP-1(Liver Fatty acid binding proin) 肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白抗原100 ul 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白ERp72抗體LFABP/FABP-2(Liver Fatty acid binding proin) 肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白抗原20 ul 結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白ESAT6抗體LN (laminin) 層粘連蛋白(多肽抗原)1 Kit 真核翻譯起始因子1抗體Laminin Beta1 peptide 層粘連蛋白β1抗原500 ul 上皮粘連調(diào)控蛋白ESRP2抗體lamin A 核纖層蛋白A抗原100 ul |