PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡(jiǎn)便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價(jià)格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會(huì)影響檢測(cè)的敏感性 非特異性產(chǎn)物會(huì)影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。 產(chǎn)品名稱 | 堪薩斯分枝桿菌探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒 | 英文名稱 | Mycobacterium kansasii | 貨號(hào) | YSP96950 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí),引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí),Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測(cè),縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計(jì)難度大; 只能用于檢測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! phospho-Caveolin-2(Tyr19) 英文名稱: 酸化細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-2抗體 0.1ml Anti-BECN1 BECLIN-1抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml Phospho-ELk1(Ser383) 英文名稱: 酸化細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ELK1抗體 0.1ml X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白/細(xì)胞堿基切除修復(fù)基因抗體 Anti-XRCC1 0.1ml Anti-TSLPR/CRLF2/FITC 熒光素標(biāo)記兔抗人、大、小鼠胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素受體抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml Rhesus antibody Rh Phospho-IKK alpha/IKK beta (Ser180/Ser181) 酸化KB抑制蛋白激酶α/β抗體 規(guī)格 0.1ml CASP4(Caspase-4) 半胱胺酸蛋白酶蛋白-4抗原Multi-class antibodies規(guī)格: 0.5mg C10orf140 英文名稱: 10號(hào)染色體開放閱讀框140抗體 0.2ml Anti-Phospho-PDGF Receptor beta (Tyr1021) 酸化血小板源性生長(zhǎng)因子受體-B抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml Human Protein C ELISA Kit 人蛋白CMulti-class antibodies規(guī)格: 48T Anti-PSMD9 蛋白酶調(diào)解因子9Multi-class antibodies規(guī)格: 0.2ml Rhesus antibody Rh HCG alpha(4A8) 人絨毛膜促性腺激素α 亞基單抗 規(guī)格 0.1ml 大鼠卵巢癌標(biāo)志物CA125ELISA Kit 大鼠卵巢癌標(biāo)志物CA125 96T PRL 英文名稱: 泌乳素抗體 0.1ml OF發(fā)酵管20支OF發(fā)酵管BR ONPG發(fā)酵管20支ONPG發(fā)酵管BR 肝素抗凝管5毫升肝素抗凝管 10毫升 Rambach瓊脂250克Rambach瓊脂金黃色葡萄球菌快速顯色分離培養(yǎng) 耶爾森氏菌顯色培養(yǎng)基250克耶爾森氏菌顯色培養(yǎng)基耶爾森氏菌快速顯色分離培養(yǎng) 堪薩斯分枝桿菌探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)樣蛋白2抗體PPIG/FITC 熒光素標(biāo)記親環(huán)蛋白(親環(huán)素)PPIG抗體IgG100 ul 15號(hào)染色體開放閱讀框62抗體PR/FITC 熒光素標(biāo)記孕激素受體抗體IgG100 ul 15號(hào)染色體開放閱讀框41抗體pRb/p105-Rb /FITC 熒光素標(biāo)記酸化成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤抑癌蛋白抗體IgG100 ul 環(huán)核苷酸陽離子通道蛋白α2抗體PRCP/FITC 熒光素標(biāo)記脯氨酰羧肽酶抗體IgG100 ul 鈣連蛋白抗體Rb/RB1 proin/FITC 熒光素標(biāo)記視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG100 ul 二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2抗體Phospho-Rb (Ser608) /FITC 熒光素標(biāo)記酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG100 ul 細(xì)胞色素P450ⅡE1抗體Phospho-Rb (Ser780)/FITC 熒光素標(biāo)記酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG20 ul 趨化因子受體1抗體Phospho-Rb (Ser807/Ser811)/FITC 熒光素標(biāo)記酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1抗體IgG100 ul 酸化原癌基因c-Raf抗體PRDX3/FITC 熒光素標(biāo)記過氧化還原酶3抗體IgG100 ul |