PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 尼泊爾葡萄球菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Staphylococcus nepalensis | 貨號 | YSP97214 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團,3'端標(biāo)記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 視黃醇飽和酶(RETSAT)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >98.0%(GC) 宇佐美曲霉變種 5g 視黃醇脫氫酶12(RDH12)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 大腸埃希氏菌 1g 視黃醇脫氫酶11(RDH11)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 橙色單胞菌 5g 視黃醇脫氫酶10(RDH10)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >99.0% (HPLC) 糞產(chǎn)堿桿菌* 25g 視黃醇脫氫酶8(RDH8)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >99.0% (HPLC) 旱生紅曲霉 5g 視黃醇脫氫酶5(RDH5)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 空腸彎曲桿菌 1g 網(wǎng)鈣蛋白3(RCN3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 熒光假單胞桿菌 5g 網(wǎng)鈣蛋白2(RCN2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 大腸埃希菌 1g 網(wǎng)鈣蛋白1(RCN1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 金針菇—金白1號 25g 核糖激酶(RBKS)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% Actinomadura amylolytica 5g 6-丙酮酰四氫蝶呤合酶(PTS)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 糙皮側(cè)耳 1g 脂酰絲氨酸合酶2(PTDSS2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 小麥蒼白桿菌 5g 脂酰絲氨酸合酶1(PTDSS1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 栗疫菌 1g 表膠質(zhì)蛋白(PRX)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 腐生葡萄球菌 5g 魚精蛋白2(PRM2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 95% 豇豆慢生根瘤菌 250mg 魚精蛋白1(PRM1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 大腸埃希氏菌 1g 催乳素受體(PRLR)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 耶爾森氏菌 25g 脯氨酰內(nèi)肽酶(PREP)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 水稻節(jié)桿菌 5g 尼泊爾葡萄球菌探針法熒光PCR檢測試劑盒凝血酶原酶(纖維介素)抗體Humen IFN- Beta β-干擾素100 ul 衰老關(guān)鍵蛋白抗體Humen IFN- Gamma γ-干擾素500 ul 凋亡調(diào)節(jié)基因之一抗體Collagen I I型膠原1 Kit 凋亡調(diào)節(jié)基因之一抗體(短型)PINP I型前膠原肽100 ul 纖維連接蛋白抗體Collagen III III型膠原100 ul FosB蛋白抗體PIIICP III型前膠原肽(C端)20 ul FRA2/FOSL2抗體PIIINP III型前膠原肽(N端)100µl 叉頭蛋白P3抗體Collagen IV IV型膠原100 ul 成纖維細(xì)胞生長因子8抗體Collagen VI VI型膠原100 ul |