客戶(hù)只需提供樣品和待檢測(cè)基因名稱(chēng)即可。由我們提取RNA，設(shè)計(jì)并合成引物，完成熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告給您。

熒光定量PCR試劑盒技術(shù)：
產(chǎn)品僅用于科研本實(shí)用新型技術(shù)公開(kāi)了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括盒體，盒體由上盒體和下盒體組成，上盒體的底面上設(shè)有限位凸起，下盒體的頂面上設(shè)有與限位凸起匹配的凹槽，且在下盒體左右側(cè)壁的下端均軟連接有側(cè)蓋，側(cè)蓋遠(yuǎn)離下盒體的一端連接有卡勾，下盒體的上端邊緣處設(shè)有環(huán)形凸起，兩個(gè)卡勾分別勾住環(huán)形凸起的左右兩端將上盒體固定在下盒體上；凹槽的內(nèi)部設(shè)有固定桿，固定桿上通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)件轉(zhuǎn)動(dòng)連接有用于放置試管的試管架；下盒體的左右兩側(cè)均設(shè)置有收納槽。本實(shí)用新型技術(shù)通過(guò)將盒體分為上下組合的兩個(gè)部分，并將兩個(gè)部分通過(guò)側(cè)蓋連接，即可保證試劑盒的便攜性，同時(shí)使用試劑盒自帶的試管可提高檢測(cè)的效率。
樣品RNA的抽提：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA質(zhì)量檢測(cè)
1）紫外吸收法測(cè)定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測(cè)定
A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 g/ml。
考馬斯亮藍(lán)R250Erk3 Antibody氯-2-氟

考馬斯亮藍(lán)G250Pan-Cadherin Antibody

溴酚藍(lán)Pan-Cadherin Antibody1-芐基吡咯烷-羧酸乙酯

固藍(lán)BPhospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjuga)2-甲硫基-嘧啶酮

氯化硝基四氮唑藍(lán)Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)硝酸鋱

甲藍(lán)OTri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb (PE Conjuga)2,6-二甲基溴

阿利新藍(lán)8GXPhospho-Tuberin/TSC2 (Ser664) (D3B9Z) Rabbit mAb2,二甲基溴

四氮唑藍(lán)；BTPan-Cadherin (28E12) Rabbit mAb2,二氯酚

噻唑藍(lán);MTTPan-Cadherin (28E12) Rabbit mAb5-甲基異惡唑

藍(lán)(水溶)Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjuga)5-巰基-1H-四氮唑-1-乙酸

紅Phospho-CASC5 (Thr943/Thr1155) (D8D4N) Rabbit mAb2-溴-1,3,5-三

亮藍(lán)Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)多庫(kù)脂鈉

索非那新琥珀酸鹽GEF-H1 (55B6) Rabbit mAb6-溴-2-萘甲酸

結(jié)晶紫F4/80 (BM8.1) Rat mAb (violetFluor™ 450 Conjuga)羥基-2-甲酸

結(jié)晶紫(進(jìn)口)His-Tag (27E8) Mouse mAb (Sepharose® Bead Conjuga)溴-2-氟甲

硝基四唑紫(INT)TNFRSF8/CD30 Antibody5-羥基喹啉

乙基紫Phospho-STING (Ser366) (D8K6H) Rabbit mAb氨基喹啉

酸性紫49Hoechst 33342膽固
腸道腺病毒41型探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒KI-67 ELISA試劑盒TrK A  酪氨酸激酶A抗體100 ul

Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(KEAP1)ELISA試劑盒Phospho-TrkA (Tyr490)/TrkB (Tyr516)  酸化酪氨酸激酶A抗體100 ul

I型膠原(COL1)ELISA試劑盒Phospho-TrkA (Tyr674/675)/TrkB (Tyr706/707)  酸化酪氨酸激酶A抗體100 ul

II型角蛋白,細(xì)胞骨架71(KRT71)ELISA試劑盒Phospho-TrkA (Tyr785)/TrkB (Tyr816)  酸化酪氨酸激酶A抗體20 ul

G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(GPBAR1)ELISA試劑盒Trk A/B/C  酪氨酸激酶A/B/C抗體100 ul

GTP酶 KRas ELISA試劑盒Trk B  酪氨酸激酶B抗體100 ul

Ghrelin受體(Ghsr)ELISA試劑盒Trk B  酪氨酸激酶B抗體20 ul

GATA結(jié)合蛋白4(GATA4)ELISA試劑盒Trk C  酪氨酸激酶C抗體(神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的一種)100 ul

F-肌動(dòng)蛋白ELISA試劑盒Trop-2  原肌球蛋白抗體20 ul
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
    10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μ
      Taq酶（2U/μl）            1μl
      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
      加ddH2O至               50 μl
   視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。好設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．產(chǎn)品僅用于科研所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。