PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進(jìn)行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)氣克雷伯氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Klebsiella aerogenes | 貨號 | YSP96863 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團,3'端標(biāo)記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 2,雙(2,4,5-*基-噻吩基)馬來酰亞1-芐基-氨基哌啶雙鹽酸鹽 順-1,2-二基-1,2-雙(2,4,5-*基-噻吩基)(>98.0%(N))1-芐基-哌啶酮鹽酸鹽 1,2-雙[2-并[b]噻吩-基]-3,3,4,4,5,5-六氟-1-環(huán)戊(>97.0%(GC))鹽酸二 1,2-雙(2,二甲基-5-基-噻吩基)-3,3,4,4,5,5-六氟-1-環(huán)戊(>98.0%(HPLC))溴 1-(2-羥基)-3,二甲基吲哚啉-6'-并螺吡喃(>93.0%(HPLC)(T))噠羧酸 螺[1,3,*基吲哚并二氫吡喃][光致變色化合物](>98.0%(HPLC)(T))碳酸銨 1,3,*基吲哚-6'-并二氫吡喃并螺烷 [光致變色化合物](>98.0%(HPLC)(T))D-核糖 螺[1,3,*基吲哚-(6'-溴并二氫吡喃)][光致變色化合物](>98.0%(T))酰溴 螺[1,3,*基吲哚-(8'-甲氧基并二氫吡喃)][光致變色化合物](>98.0%(T))2-溴肼鹽酸鹽 1,3,*基吲哚-β-萘基二[光致變色化合物](>98.0%(T))2,6-二肼鹽酸鹽 1,3,*基吲哚-奈諤(>98.0%(HPLC)(T))甲氧基芐 1,1'-雙(2,二基)-4,4'-二化聯(lián)吡啶(>97.0%(HPLC))溴代叔丁烷 1,1'-二甲基-4,4'-聯(lián)吡啶鎓鹽二化物水合物(>98.0%(HPLC)(T))代叔丁烷 1,1'-二庚基-4,4'-二溴化聯(lián)吡啶鎓(>98.0%(HPLC)(T))2,5-二甲酸 1,1'-二正辛基-4,4'-聯(lián)二溴化吡啶嗡(>98.0%(T))甲氧基-甲酸 1,1'-二芐基-4,4'-聯(lián)吡啶鎓鹽二化物水合物(>98.0%(HPLC))2,二甲酸 1,1'-二基-4,4'-二化聯(lián)吡啶鎓(>97.0%(HPLC)(T))1-基甲酸酯 1,1'-二甲基-4,4'-二化聯(lián)吡啶鎓(>98.0%(HPLC)(T))(1,5-環(huán)辛二)二化釕(II) 產(chǎn)氣克雷伯氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒膽固25α7羥化酶抗體Ki-67/FITC 熒光素標(biāo)記Ki-67 Antigen抗體IgG100 ul 細(xì)胞角蛋白3+12抗體Kif14 proin /FITC 熒光素標(biāo)記驅(qū)動蛋白家族Member14蛋白抗體IgG100 ul 接頭蛋白CrkL抗體Kiss-1/FITC 熒光素標(biāo)記腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因抗體IgG100 ul 細(xì)胞色素P450 24A1抗體KIF17/FITC 熒光素標(biāo)記驅(qū)動蛋白家族KIF17抗體IgG20 ul 細(xì)胞色素P450 2R1抗體PFK2/PFKFB3 /FITC 熒光素標(biāo)記6酸果糖激酶2抗體IgG100 ul 銅代謝結(jié)構(gòu)域蛋白10抗體Phospho-PFK2 (Ser466) /FITC 熒光素標(biāo)記酸化6酸果糖激酶2抗體IgG100 ul 鈣周期素結(jié)合蛋白抗體KLF2/FITC 熒光素標(biāo)記兔抗、大、腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子/上皮鋅指蛋白2抗體IgG20 ul 7號染色體開放閱讀框69抗體Klf4/FITC 熒光素標(biāo)記腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子/上皮鋅指蛋白K抗體IgG1 Kit 銅代謝結(jié)構(gòu)域蛋白3抗體KLF5/FITC 熒光素標(biāo)記腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子5抗體IgG100µl |