PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 雞白痢沙門氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Salmonella pullorum | 貨號 | YSP97168 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 鈣調(diào)蛋白1(CALM1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 東方伊薩酵母 1g 白介素17C(IL17C)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 色串孢屬 5g 激肽釋放酶13(KLK13)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 棲果刺盤孢 100g 激肽釋放酶15(KLK15)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 停滯棒桿菌 25g 硫氧還蛋白還原酶2(TrxR2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 枯草芽孢桿菌枯草亞種 5g 硫氧還蛋白還原酶3(TrxR3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 人葡萄球菌 25g 胰蛋白(PANCPIN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 冰川金色單胞菌 5g 絲氨酸蛋白酶肽酶抑制因子B支成員13(SERPINB13)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥98% 褐紅小孔菌 1g 絲氨酸蛋白酶肽酶抑制因子B支成員12(SERPINB12)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥98% 紅細(xì)菌屬 25g 絲氨酸蛋白酶肽酶抑制因子B支成員10(SERPINB10)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥98% Corynebacterium variabile 5g 絲氨酸蛋白酶肽酶抑制因子B支成員7(SERPINB7)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 南海雷*氏菌 1g 胞漿抗蛋白水解酶2(CAP2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 熱橄欖鏈霉菌褐色變種 5g 絲氨酸蛋白酶肽酶抑制因子A支成員9(SERPINA9)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 副豬嗜血桿菌 1g 激肽釋放酶結(jié)合蛋白(KAL)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 四川散斑殼 5g 肝素酶2(HPA2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >97.0%(GC) 沙漠畢赤酵母 1g 前腦啡肽(PENK)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >97.0%(GC) 灰色鏈霉菌 25g 孤菲肽原(PNOC)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) >97.0%(GC) 點枝頂孢 5g 強啡肽原(PDYN)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) ≥95%(GC) 阿舒假囊酵母 100g 雞白痢沙門氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒EMSY蛋白抗體ADAMTS-7(a disingrin-like and metalloproase-7 ) 新型金屬基質(zhì)蛋白酶(抗原)100 ul FBXO36 F-box蛋白相關(guān)蛋白36抗體Adiponectin 脂聯(lián)素(多肽片斷抗原)100 ul CAST1蛋白抗體Adipo R1(adiponectin receptor 1) 脂聯(lián)素受體-1(抗原)100 ul RAB6蛋白抗體Adipo R2(adiponectin receptor 2) 脂聯(lián)素受體-2(抗原)1 Pack 皮卡丘素抗體PSAP/PAP peptide 前列腺酸性酸酶抗原1 Pack ELAVL4蛋白抗體PSAP/PAP peptide (human) 前列腺酸性酸酶抗原()1 Pack 表皮生長因子樣激素受體1P-selectin P選擇素抗原100 ul 酸化絲裂原活化蛋白激酶1/2抗體CD63/MLA1 溶酶體膜糖蛋白抗原1 Pack 電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α抗體PN/MMAC1(CT)human, mo, rat, pig, dog, bovine, horse, chicken 一種腫瘤抑制基因抗原(C端)1 Pack |