熒光定量PCR試劑盒技術(shù)：
產(chǎn)品僅用于科研本實(shí)用新型技術(shù)公開了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括盒體，盒體由上盒體和下盒體組成，上盒體的底面上設(shè)有限位凸起，下盒體的頂面上設(shè)有與限位凸起匹配的凹槽，且在下盒體左右側(cè)壁的下端均軟連接有側(cè)蓋，側(cè)蓋遠(yuǎn)離下盒體的一端連接有卡勾，下盒體的上端邊緣處設(shè)有環(huán)形凸起，兩個(gè)卡勾分別勾住環(huán)形凸起的左右兩端將上盒體固定在下盒體上；凹槽的內(nèi)部設(shè)有固定桿，固定桿上通過轉(zhuǎn)動件轉(zhuǎn)動連接有用于放置試管的試管架；下盒體的左右兩側(cè)均設(shè)置有收納槽。本實(shí)用新型技術(shù)通過將盒體分為上下組合的兩個(gè)部分，并將兩個(gè)部分通過側(cè)蓋連接，即可保證試劑盒的便攜性，同時(shí)使用試劑盒自帶的試管可提高檢測的效率。
客戶只需提供樣品和待檢測基因名稱即可。由我們提取RNA，設(shè)計(jì)并合成引物，完成熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告給您。

樣品RNA的抽提：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA質(zhì)量檢測
1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 g/ml。
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
    10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μ
      Taq酶（2U/μl）            1μl
      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
      加ddH2O至               50 μl
   視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。好設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．產(chǎn)品僅用于科研所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
DMT保護(hù)性脫氧肌苷Phospho-Bad (Ser112) (7E11) Mouse mAb (Biotinylad)

N-乙?；?5'-O-(4,4'-二甲氧基*基)-2'-脫氧胞苷Lipin 1 Antibody5-羥基-2-戊酮

保護(hù)胸甙(DMT-T)Lipin 1 Antibody

DMT保護(hù)性脫氧尿苷NDRG1 Antibody氯乙

D-木糖(標(biāo)準(zhǔn)品)EpCAM (VU1D9) Mouse mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)1,3,2-二噁唑噻吩-2,2-二氧化物

D-木糖NCAM1 (CD56) (MY31) Mouse mAb (APC Conjuga)乙

2',3'-二脫氧尿苷(ddU)Phospho-eIF2α (Ser51) (D9G8) XP® Rabbit mAb (Biotinylad)2-乙酰基吡咯

潮霉素BMalic Enzyme 3 Antibody1H-咪唑-甲酸

5'-O-(4,4'-二甲氧基三基)-N2-異丁?；?2'-脫氧鳥苷(DMT-ibu- dG)AKAP1 (D9C5) XP® Rabbit mAb1,3,5-*基吡唑

N甲酰基-5'-O-(4,4'-二甲氧基三基)-2'-脫氧胞甘(DMT- Bz- dC）AKAP1 (D9C5) XP® Rabbit mAb2-氨基-5-溴吡啶

N6-甲?；?5'-O-(4,4'-二甲氧基*基)-2'-脫氧腺苷(DMT-dA-Bz)Mouse Inrleukin-1β (mIL-1β)(甲硫基)酚

rU亞酰單體Mouse Inrleukin-1β (mIL-1β)2-溴乙

Bz-rA亞酰單體TAK1 (D94D7) Rabbit mAb3,二氟環(huán)丁烷羧酸

i-bu-rG亞酰單體Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb (HRP Conjuga)甲基-硝基吡啶-N-氧化物

PF299804（EGFR抑制劑）Mouse Inrleukin-4 (mIL-4)2,二甲基-5-硝基吡啶

Ac-rC亞酰單體Mouse Inrleukin-4 (mIL-4)(氨基)

氟尼辛葡Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb (Biotinylad)2,二氨基甲酸甲酯

氟尼辛葡(標(biāo)準(zhǔn)品)SOCS3 (D6E1T) Rabbit mAbalpha-硫辛酸
佩氏著色霉探針法熒光PCR檢測試劑盒內(nèi)收蛋白抗體CCL4/MIP-1 Beta/FITC  熒光素標(biāo)記巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β抗體IgG100 ul

脂肪組織分化相關(guān)蛋白抗體CCL5/RANS/FITC  熒光素標(biāo)記調(diào)節(jié)活化的正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的因子IgG100 ul

脂聯(lián)素受體1抗體CCL6/C10/FITC  熒光素標(biāo)記嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白CCL6抗體IgG20 ul

腎上腺髓質(zhì)素受體抗體CCL9/CCL10/MIP-1 Gamma/FITC  熒光素標(biāo)記巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1γ抗體IgG100 ul

脂聯(lián)素抗體CCL11/FITC  熒光素標(biāo)記嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白抗體IgG100 ul

腎上腺髓質(zhì)素抗體CCL12/MCP-5/FITC  熒光素標(biāo)記單核細(xì)胞趨化蛋白5抗體IgG100 ul

腺苷受體A3抗體CCL13/MCP-4/FITC  熒光素標(biāo)記單核細(xì)胞趨化蛋白4抗體IgG300 ul

ADRA2腎上腺素能受體2抗體CCL14/HCC-1/FITC  熒光素標(biāo)記嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白14抗體IgG100 ul

腎上腺素能受體β1抗體CYLD/cylindromatosis 1/FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、微管結(jié)合蛋白CYLD抗體IgG20 ul