客戶(hù)只需提供樣品和待檢測(cè)基因名稱(chēng)即可。由我們提取RNA，設(shè)計(jì)并合成引物，完成熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告給您。

熒光定量PCR試劑盒技術(shù)：
產(chǎn)品僅用于科研本實(shí)用新型技術(shù)公開(kāi)了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括盒體，盒體由上盒體和下盒體組成，上盒體的底面上設(shè)有限位凸起，下盒體的頂面上設(shè)有與限位凸起匹配的凹槽，且在下盒體左右側(cè)壁的下端均軟連接有側(cè)蓋，側(cè)蓋遠(yuǎn)離下盒體的一端連接有卡勾，下盒體的上端邊緣處設(shè)有環(huán)形凸起，兩個(gè)卡勾分別勾住環(huán)形凸起的左右兩端將上盒體固定在下盒體上；凹槽的內(nèi)部設(shè)有固定桿，固定桿上通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)件轉(zhuǎn)動(dòng)連接有用于放置試管的試管架；下盒體的左右兩側(cè)均設(shè)置有收納槽。本實(shí)用新型技術(shù)通過(guò)將盒體分為上下組合的兩個(gè)部分，并將兩個(gè)部分通過(guò)側(cè)蓋連接，即可保證試劑盒的便攜性，同時(shí)使用試劑盒自帶的試管可提高檢測(cè)的效率。
樣品RNA的抽提：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA質(zhì)量檢測(cè)
1）紫外吸收法測(cè)定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測(cè)定
A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 g/ml。
鳥(niǎo)苷-5'-三酸二鈉鹽Frizzled6 (D16E5) Rabbit mAb2-氧代環(huán)戊烷羧酸甲酯

腺苷-5'-二酸三鋰鹽MYH Antibody二乙基

(R)-1-Boc-氨甲基哌啶Cas9 (<i>S. aureus</i>) (E4G3U) Rabbit mAb2-氟-5-羥基甲

赤蘚;赤蘚糖MED1 Antibody甲基氯芐

5ˊ-二酸腺苷鋇鹽Phospho-ATRIP (Ser224) Antibody2-氨基-吡啶

二酸腺苷單鹽Phospho-MYPT1 (Thr696) Antibody對(duì)甲甲

肌苷-5'-二酸二鈉鹽Phospho-MYPT1 (Thr696) Antibody環(huán)戊基酰氯

腺苷-5’-二酸一鈉Geminin Antibody5,6,7,8-四氫喹啉

D-纖維二糖5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb2-溴-5-甲氧基吡啶

胞苷-5'-二酸二鈉鹽(CDP.Na2)EAPP (1E4) Mouse mAb四丁基醋酸銨

胞苷-5'-單酸二鈉鹽(CMP.Na2)EED Antibody2-甲氧基-吡啶甲酸

TFA-aa-UVEGF Receptor 2 (55B11) Rabbit mAb (Sepharose Bead®Conjuga)[1-(二甲基氨基)乙基]酚

TFA-aa-dUeIF4G2/p97 (D88B6) XP® Rabbit mAb己內(nèi)酰

5-尿苷N-Myc (D4B2Y) Rabbit mAb(羥基基)環(huán)己酮

5--2'-脫氧尿苷(苷)SimpleChIP® Human H19/Igf2 Imprinting Control Region Primers2-氟-5-甲氧基甲

5--2'-脫氧胞苷Phospho-CD79A (Tyr182) Antibody氨基-吡啶

2'-甲氧基尿苷Phospho-CD79A (Tyr182) Antibody四甲基醋酸銨

2'-甲氧基胞苷GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb1-溴-氟-
博茲曼熒光桿菌探針?lè)晒釶CR檢測(cè)試劑盒ANKLE2蛋白抗體cath-L/CL /FITC  熒光素標(biāo)記組織蛋白酶L抗體IgG100 ul

特異性錨樣蛋白1抗體Cathepsin B/FITC  熒光素標(biāo)記兔抗組織蛋白酶B抗體IgG100 ul

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白13B抗體Cav-1/FITC  熒光素標(biāo)記抗小凹蛋白抗體IgG300 ul

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白20A1抗體Caveolin-3/FITC  熒光素標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-3抗體IgG100 ul

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白20A3抗體CACH2/CaV1.2/FITC   熒光素標(biāo)記L型鈣通道蛋白抗體IgG100 ul

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白22抗體CACNA1G/Cav3.1 /FITC   熒光素標(biāo)記電壓依賴(lài)性鈣通道Cav3.1抗體IgG100 ul

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白50抗體CBFA1/RUNX2/FITC  熒光素標(biāo)記成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子抗體IgG100 ul

氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合成酶6G抗體CBL2 /FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、原癌蛋白CBL2抗體IgG500µl

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白26抗體phospho-CBL2(Tyr731) /FITC  熒光素標(biāo)記酸化原癌蛋白CBL2抗體IgG100 ul
實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
    10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μ
      Taq酶（2U/μl）            1μl
      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
      加ddH2O至               50 μl
   視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。好設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．產(chǎn)品僅用于科研所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。