PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 火雞沙門氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Salmonella meleagridis | 貨號 | YSP97162 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實(shí)驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強(qiáng)度信號,這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 尿皮質(zhì)素3(UCN3)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 假單胞菌屬 5g 斜方蛋白1(RHOM1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 屎腸球菌 1g 核糖核酸外切酶1(ERI1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 蘇云金芽孢桿菌 5g 核糖核酸酶K(RNASEK)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 赭裸傘 100g 5'-3'外切核糖核酸酶1(XRN1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 豇豆慢生根瘤菌 25g 5'-3'外切核糖核酸酶2(XRN2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 99% 產(chǎn)氨短桿菌 5g 核糖核酸酶A2(RNASE2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 球形節(jié)桿菌 1g 泛素C(UBC)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 瓜類鞘氨醇單胞菌 25g 干擾素ε(IFNε)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 髓囊畢赤酵母 5g 干擾素κ(IFNκ)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 聚硼貪噬菌 1g 對氧酶2(PON2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 芽孢乳酸菌干粉 5g 核連蛋白1(NUCB1)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) tech. 85% 釀酒酵母 1g 核連蛋白2(NUCB2)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) tech. 85% 豌豆根瘤菌 5g 速激肽4(TAC4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 微白黃鏈霉菌 25g 粘蛋白21(MUC21)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 97% 河北鏈霉菌 5g 蔗糖酶異麥芽糖酶(SI)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 費(fèi)氏中華根瘤菌 100g 核糖核酸酶A4(RNASE4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 大腸埃希菌 25g 核糖核酸酶A8(RNASE8)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法) 98% 釀酒酵母 5g 火雞沙門氏菌探針法熒光PCR檢測試劑盒腺樣癌特異性相關(guān)抗原EMC1抗體ompF(putative our membrane porin F proin) 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌膜通道蛋白抗原100 ul 腺樣癌特異性相關(guān)抗原EMC1抗體OLFM1 peptide 嗅球蛋白1多肽抗原100 ul 硫酸軟骨素蛋白多糖3抗體ORX-A(orexin-A) 增食欲素-A/欲激素A抗原400 ul 染色體區(qū)域穩(wěn)定蛋白/核輸出蛋白1抗體OTR(oxytocin receptor) 縮宮素受體100 ul 酸化細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ELK1抗體OXR (Orexin receptor) 食欲素受體(多肽)100 ul ETS相關(guān)蛋白71抗體P2P-R/RBBP6(proliferation pontial proin relad) 增殖潛能相關(guān)蛋白抗原100 ul 外胚層發(fā)育不良蛋白1抗體P19ARF p19ARF抑癌基因抗原20 ul ETV3L蛋白抗體phospho-p38 ERK/MAPK14 (pThr180/pTyr182) peptide 酸化絲裂原活化蛋白激酶p38抗原100 ul 酪氨酸蛋白激酶受體B6抗體MKK3(MAP Kinase Kinase 3) 絲裂原活化蛋白激酶MKK3/6抗原100 ul |