PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡(jiǎn)便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價(jià)格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會(huì)影響檢測(cè)的敏感性 非特異性產(chǎn)物會(huì)影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。 產(chǎn)品名稱 | 鴨肝炎病毒通用探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒 | 英文名稱 | Duck Hepatitis Virus(DHV) | 貨號(hào) | YSP96631 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí),引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí),Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測(cè),縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計(jì)難度大; 只能用于檢測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! L-甘氨酸甲酯鹽酸鹽TNF-R2 Antibody2-氟-甲氧基甲酸 D-氨酸乙酯鹽酸鹽Sox2 (C70B1) Rabbit mAb (IHC Preferred)()-羥基哌啶 利格列汀;利拉利汀OSR1 Antibody1-(2-)哌 L-谷氨酸-α-芐酯Caspr2 Antibody1-芐基-氧雜-哌啶甲酸乙酯 L-亮氨酸乙酯鹽酸鹽GP130 Antibody1-氯甲?;?甲基哌 L-氨酸芐酯對(duì)甲磺酸鹽Phospho-MLKL (Ser345) (D6E3G) Rabbit mAb2-(三氟甲基)芐溴 L-氨酰鹽酸鹽NPRL2 (D8K3X) Rabbit mAb哌啶-甲酰 L-組氨酸鹽酸鹽NF-κB2 p100/p52 (D7A9K) Rabbit mAb四溴噻吩 L-高精氨酸鹽酸鹽MCM7 (D10A11) XP® Rabbit mAb對(duì)溴芐 氨基酸甲酯鹽酸鹽MCM7 (D10A11) XP® Rabbit mAb1,1-環(huán)烷二甲 TPCK(進(jìn)分)TNF-R1 (C25C1) Rabbit mAb氯-甲酸 TPCKTNF-R1 (C25C1) Rabbit mAb氯-2-氨基吡啶 D-纈氨酰-L-亮氨酰-L-賴氨酸-對(duì)-PHF8 (E9R4F) Rabbit mAb2-氨基-間二甲酸 谷二肽,L--谷二肽,力肽SUZ12 (D39F6) XP® Rabbit mAb溴喹啉 L-精氨酸甲酯SUZ12 (D39F6) XP® Rabbit mAbN-Boc-溴乙 D-氨酰鹽酸鹽Beclin-1 Antibody2-氯-硝 硝酸芬替康唑; 硝酸芬康唑Myc-Tag (9B11) Mouse mAb (PE Conjuga)2-氨基-異鄰二甲酸 1-芐基D-谷氨酸SDF1 Antibody叔丁基氯化 鴨肝炎病毒通用探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒單核細(xì)胞趨化蛋白4(MCP-4)ELISA試劑盒phospho-Src(Tyr529) 酸化Src原癌基因抗體100 ul 單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP-3/CCL7)ELISA試劑盒phospho-Src (Tyr418) 酸化Src原癌基因抗體100 ul 單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP-2/CCL8)ELISA試劑盒SRF/SAP2/MCM1 生長(zhǎng)激素釋放因子抗體(血清應(yīng)答因子)20 ul 單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2/MCAF)ELISA試劑盒Phospho-SRF (Ser103) 酸化生長(zhǎng)激素釋放因子抗體(血清應(yīng)答因子)100 ul 單氧化酶(MAO)ELISA試劑盒SREBP-1 膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1抗體100 ul 大內(nèi)皮素1ELISA試劑盒SREBP-2 膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2抗體100 ul 催素(PRL)ELISA試劑盒srGAP3 精神障礙相關(guān)GAP蛋白抗體100 ul 催產(chǎn)素(OT)ELISA試劑盒synaptotagmin-2 突觸結(jié)合蛋白相關(guān)基因2抗體100 ul 促胰液素/胰泌素(Sct)ELISA試劑盒Synaptotagmin-4 突觸結(jié)合蛋白4抗體100 ul |